第二代试管婴儿技术又称细胞浆内单精子显微注射(ISCI)，是指取出精子卵子后，用显微注射器将男性单个精子注入女性细胞浆中，使精子与卵子被动结合形成受精卵的技术。一般二代试管婴儿精子优化的方法有精子洗涤法、上游法、下游法、密度梯度离心法等。期中密度梯度离心法操作容易标准化、精子回收率较高，是IVF/ICSI常用的精液标本制备方法，但是当精子浓度很低时并不适用。
二代试管精子优化处理方法
精子洗涤法
用培养液稀释精液标本，直接离心，收集沉淀的精子团。这种方法可以回收尽可能多的精子，但与死精子和其他细胞碎片混合。
上游法
上游方法是将精液和培养液一起孵化，使活性好的精子游到上层培养液中。该方法可去除精浆和精浆中抑 制受精的物质，实现体外能量获取。其优点是操作简单，成本低，不良反应少，颗粒大小更高，效果更低DNA精子的碎片率。
下游法
将灭活血清置于试管底部。将洗过的精子悬液轻轻放在血清上，形成界面。37岁。℃孵化，用细长的吸管插入试管底部，吸收大部分含有活动精子的血清备用。上游法应克服重力向上游，回收率低，下游法避免了这一缺点，提高了精子的回收率。
密度梯度离心法
将精液放置在不同密度的梯度培养液上方。在离心过程中，由于密度不同而分离。常用的密度梯度液为上层40%和下层80%。此外活动精子主动游动，通过梯度液在离心管底部形成柔软的沉淀团，可获得部分活力良好的精子，不含碎片、白细胞、非精子细胞和退化精子细胞。
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